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层析柱的操作方法

以中压柱层析法提取分离冬凌草甲素为例：

　　1.吸附剂的处理及柱子装填

　　将一定量薄层层析硅胶装入搪瓷盘置于烘箱中，于105。c活化2h后，取出放置室温即可装柱。柱子采用干法填充，填满整个柱体，不留死体积，密封后用柱塞式计量溶剂泵按一(5：95)比例泵入溶剂，至溶剂流出止。

　　2.上样

　　将冬凌草的---提取物400g用适量溶解，泵入中压柱柱头，然后泵入1000rid。

　　3.洗脱

　　以一定比例的一为洗脱液，60ml/min的流速进行梯度洗脱，阴阳树脂柱，柱的使用压力为2～ 3kg/c 。按每份500ml收集，tlc检识展开剂一(2：8)，显色剂5%香草醛---液

　　至洗脱完全，相同流份合并，阴阳树脂柱生产商，回收溶剂。将冬凌草甲素流份合并蒸干。加入适量热溶后自然放置，析出结晶，为冬凌草甲素。

　　4.层析柱再生、平衡

　　有效成分经tlc检识全部流出后，用纯5000ml再生，一(5：95)平衡后，可再次上样，反复使用(使用次数随原料不同而异，一般可连续使用2—6个月以上)。

　　5.重结晶

　　冬凌草甲素结晶析出完全后，减压过滤，然后用少量洗涤(洗涤液保留，作下次热溶冬凌草甲素用)。将冬凌草甲素再用适量热溶后放置，结晶再次析出，待结晶完全后，抽滤，用少量洗涤，将结晶室温下晾干后置真空干燥箱中，35度真空干燥至恒重。密封于瓶中，阴阳树脂柱价格，置干燥器中保存。

　　6.薄层层析分析

　　取适量冬凌草甲素对照品及由上述方法得到的冬凌草甲素样品溶解后点于同一硅胶g薄层板上，以一(8：2)为展开剂进行展开，5% 香草醛---液显色，于105。c烘至斑点清晰。表明在该展开系统下，冬凌草甲素样品和对照品都具有相同的rf值，并呈现出同样的蓝绿点，在制备的冬凌草甲素样品中，没有杂质斑痕。

关于层析柱装柱、使用及相关注意事项

（1）、装柱前要仔细看填料的使用说明书，每种填料都有自己的特性，以及特殊的装柱方法，针对不同的空柱，也要注意方法可能不同；这一点非常重要：装柱包括以后使用中不允许柱内进入气泡（bubble free），柱头事先也要排除气泡。

（2）、填料要加水搅拌成均匀悬液，悬液浓度依填料而不同，一般70－85%，迅速倒入空柱内，或吸或压，流速和具体步骤看说明书。

（3）、所有柱子尽量做到填料均匀，阴阳树脂柱多少钱，尤其是用于凝胶层析的柱子。装柱完成后，可用柱效测定的方法检查装填效果。一个装填合格的柱子的理论塔板高度应是填料平均粒径的2－4 倍，在此范围内越小越好。

（4）、选择合适的泵，**是流速满足要求，脉冲尽量小。柱塞泵。

（5）、准备上柱的液体应进行过滤，至少是0.45micrometre。

（6）、关于纯化，**要考虑的是你的目标：纯度、数量、速度、收率等等，再根据样品的具体情况，尤其是目标蛋白的性质，确定纯化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。*步先从大量或复杂样品---目标蛋白%26ldquo;抓出%26rdquo;，与主要杂质分离；再用高选择性的层析去除绝大部分杂质；后精细纯化，提供纯度至设定目标。到实际工作中，不要死靠三步，也许一步也许四步或更多，具体情况具体分析。所谓%26ldquo;三步%26rdquo;只是一种思路而已。

（7）、至于测序，我想大概不到1mg 应该足够了。