层析柱的操作方法
以中压柱层析法提取分离冬凌草甲素为例:
1.吸附剂的处理及柱子装填
将一定量薄层层析硅胶装入搪瓷盘置于烘箱中,于105。c活化2h后,取出放置室温即可装柱。柱子采用干法填充,填满整个柱体,不留死体积,密封后用柱塞式计量溶剂泵按一(5:95)比例泵入溶剂,至溶剂流出止。
2.上样
将冬凌草的---提取物400g用适量溶解,泵入中压柱柱头,然后泵入1000rid。
3.洗脱
以一定比例的一为洗脱液,60ml/min的流速进行梯度洗脱,柱的使用压力为2~ 3kg/c 。按每份500ml收集,tlc检识展开剂一(2:8),显色剂5%香草醛---液
至洗脱完全,相同流份合并,回收溶剂。将冬凌草甲素流份合并蒸干。加入适量热溶后自然放置,析出结晶,为冬凌草甲素。
4.层析柱再生、平衡
有效成分经tlc检识全部流出后,用纯5000ml再生,一(5:95)平衡后,可再次上样,反复使用(使用次数随原料不同而异,一般可连续使用2—6个月以上)。
5.重结晶
冬凌草甲素结晶析出完全后,减压过滤,然后用少量洗涤(洗涤液保留,作下次热溶冬凌草甲素用)。将冬凌草甲素再用适量热溶后放置,结晶再次析出,待结晶完全后,抽滤,用少量洗涤,将结晶室温下晾干后置真空干燥箱中,树脂柱生产厂家,35度真空干燥至恒重。密封于瓶中,置干燥器中保存。
6.薄层层析分析
取适量冬凌草甲素对照品及由上述方法得到的冬凌草甲素样品溶解后点于同一硅胶g薄层板上,以一(8:2)为展开剂进行展开,5% 香草醛---液显色,于105。c烘至斑点清晰。表明在该展开系统下,河北树脂柱,冬凌草甲素样品和对照品都具有相同的rf值,并呈现出同样的蓝绿点,在制备的冬凌草甲素样品中,树脂柱多少钱,没有杂质斑痕。
交换
将试液加到交换柱上,用活塞控制一定的流速进行交换。
洗脱
当交换完毕之后,一般用蒸馏水洗去残存溶液,然后用适当的洗脱液进行洗脱。在洗脱过程中、上层被交换的离子先被洗脱下来,经过下层未被交换的树脂时,又可以再度被交换。
阳离子交换树脂常采用hcl溶液作为洗脱液;阴离子交换树脂常采用nacl或naoh溶液作为洗脱液。洗脱之后的树脂已得到再生,用蒸馏水洗涤干净即可再次使用。
层析柱装柱步骤流程
1.hetp计算
所用样品为1.0%nacl或纯溶液,上样大约为总柱床体积的1%。对于34和50μm的填料,使用的线性流速应为30 cm/h,90μm的填料选择20 cm/h的线性流速。通过下式计算hetp:
hetp = l/n
其中l为柱床高度(cm),n为理论塔板数,n=5.54 (ve/wh)2;
ve为洗脱体积(ml),树脂柱供应,wh峰高一半处的峰宽(ml)。
2.峰对称因子计算
洗脱峰的峰形应尽可能对称,即对称因子尽可能接近1。as按下列公式计算:
as = b/a
其中,a为峰高10%处的前半个峰宽,b为峰高10%处后半个峰宽。
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